DNA zincirinin önceden belirlenen bir bölgesini çoğaltmak için kullanılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu moleküler genetik alanında devrim niteliği taşıyan bir yöntemdir. Real-Time PCR ise geleneksel PCR’ın uygulama alanlarını arttırırken PCR’la ilişkili pek çok laboratuvar sorununa çözüm getiren yenilikçi bir metottur. Real-Time PCR yöntemi, nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresan sinyalinin ölçülmesiyle, kantitatif sonuç alınabilen bir PCR yöntemidir. Real-Time PCR’ın avantajlarını kısaca şu şekilde açıklayabiliriz.

1- Kısa sürede sonuç almak mümkündür.  Sıcaklık döngülerinin hızlı uygulanması ve floresan okunması aynı cihaz içinde ve aynı tüp içinde gerçekleşmektedir. Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle; agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır.

2- Real-Time PCR pratiktir. Aynı cihaz içerisinde hem çoğaltma işleminin, hem de çoğaltılan ürünleri saptama işleminin yapılabilmesi, bu yöntemi çok pratik bir yöntem haline getirmiştir.

3- Kontaminasyon riski oldukça düşüktür. Tüpler açılmadan test tamamlandığı için kontaminasyon riski de azalmaktadır.

4- Mutasyon çalışması yapılmak isteniyorsa floresans veren problar kullanılarak hedef nükleik asitteki mutasyonlar kolaylıkla saptanabilmektedir

5- Rekabet nedeniyle ucuzdur.

Elde Edilen Ürünlerin Varlığı Nasıl Anlaşılır?

Real-time PCR’da amplifikasyon sonrasında elde edilen ürün varlığının saptanması çeşitli şekillerde yapılabilir. Bunlardan birincisi özgül olmayan bir yöntem olan çift zincirli DNA boyalarının kullanılmasıdır. Bu amaçla en sık kullanılan boya SYBR Green I’dir. Primerlerin bağlanmasını takiben gerçekleştirilen polimerizasyon aşamasında hedef DNA’nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA’ya bağlanan boya miktarı artar ve buna bağlı olarak yayılan floresans miktarında artış gözlenir. Elde edilen floresansın istenen hedef bölgenin amplifikasyonuyla mı gerçekleştiği, yoksa non-spesifik bir ürün mü olduğunu anlayabilmek için “melting curve” (erime eğrisi) analizi yapılır. Çoğaltılan hedefin özgül olarak saptanması amacıyla işaretli problar kullanılır. Prob formatları 7 arasında en sıklıkla FRET (Fluorescens Resonance Energy Transfer), Taqman ve Molecular Beacons yer almaktadır.

Real Time PCR’da Probların Önemi Nedir?

Aslında bu metodu geleneksel PCR yönteminden ayıran en önemli kriterlerden biri problardır. Bu nedenle özellikle uygun prob seçimi, real-time PCR işleminin verimliliğini etkileyen en önemli basamaklardan biridir. Probun işlevi, cihaz içerisinde gerçekleştirilmiş olan çoğaltma işleminin gözle görülür hale getirilmesidir. Prob kullanılmadan da, PCR tüpü içerisinde uygun primerlerin, dNTP’lerin ve enzimin kullanımıyla PCR işlemi gerçekleşecektir. Ancak prob kullanılmadan sonucun real-time PCR cihazının bilgisayarında görüntülenmesi mümkün olmayacaktır.

Elde Edilen Ürün Miktarı Nasıl Anlaşılır?

Real-time PCR’da oluşan ürün miktarı reaksiyon boyunca oluşan ürün miktarıyla orantılı olarak artan floresan boya ve probların verdiği sinyalin izlenmesiyle anlaşılır ve amplifikasyonun devir sayısı belirli miktardaki DNA moleküllerinin elde edilmesi açısında da gereklidir.

The post Real Time PCR Hakkında Bilinmesi Gerekenler appeared first on TechWorm.

Kary Mullis tarafından 1980’lerde geliştirilen devrimci bir yöntem olan PCR “polimeraz zincir reaksiyonu (polymerase chain reaction)” saflaştırılmış DNA polimerazları ve kimyasal olarak sentezlenmiş olan DNA oligonükleotidleri sayesinde özel olarak belirlenen bir DNA dizisinin canlı hücreye gerek kalmadan kopyalanması tekniğine verilen isimdir. PCR reaksiyonunun sonunda spesifik dizi milyarlarca kopya biriktirilebilir.

PCR için gereken reaktifler;

• Genomik DNA
• DNA oligonükleotidi
• Deoksiribonükleotid trifosfat (dNTPs)
• Taq DNA polimeraz

En basit haliyle, bir DNA numunesi ve bir DNA polimeraz, nükleotidler, primerler ve diğer reaktifler (yapay kimyasal bileşikler) bir numune tüpüne eklendiğinde reaksiyon oluşur. Reaktifler, DNA kodunu kopyalamak için gereken reaksiyonu kolaylaştırır.

PCR’yı başlatmadan önce, DNA örnekten izole edilmelidir. PCR temelde üç ana döngünün tekrarlarından oluşur bunlar nelerdir?

1- Denatürasyon( Denaturation): PCR’nin ilk adımı olan bu işlemde örnek DNA’yı içeren tüp, iki sarmallı DNA’yı iki ayrı ipliğe ayırır. Bu işlem 90 derecede gerçekleştirilir. Yüksek sıcaklık, DNA kodunu oluşturan nükleotidler arasındaki nispeten zayıf bağları kopartır. Sıcaklığın DNA zincirlerinin tamamen ayrıldığından emin olmak için bu aşamada yeterince uzun süre tutulması önemlidir. Bu genellikle 15-30 saniye sürer.

2- Eşleşme (Annealing): 40-60 derecede gerçekleşen bu adımda primerler tek iplikçik halindeki kalıp DNA’ya spesifik olarak bağlanırlar. Primerler DNA sentezinin başlangıç noktası olarak kullanılır. Polimeraz enzimi sadece DNA çift sarmalına DNA bazları ekleyebilir. Primer bağlandığında sadece polimeraz enzim bağlanabilir ve DNA’nın yeni tamamlayıcı zincirini gevşek DNA tabanından yapmaya başlar. Bu adım genellikle yaklaşık 10-30 saniye sürer.

3- Uzama (Extension): Bu aşamada sıcaklık yaklaşık 72 dereceye yükselir. Primerlerle işaretlenmiş bölgelerden başlayarak, çözeltideki nükleotidler Taq DNA polimeraz tarafından eşleşmiş primerlere eklenerek tekli şablon iplikçiklerinden her birine tamamlayıcı yeni bir DNA zinciri oluşturulur.

Bu aşamalardan denatürasyon ve uzama da ısılar değirmez fakat eşleşmede ısı istenen DNA dizisinin içeriğine göre değişir. DNA’nın PCR ile iki kopyasını yaptıktan sonra, tekrarlanan DNA kopyalanan DNA’yı kullanarak tekrar başlar. Her çift, iki yeni kopya oluşturur ve yaklaşık 30 veya 40 PCR devresinden sonra, orijinal DNA bölümünün bir milyardan fazla kopyası yapılmış olur. PCR işlemi otomatik olarak gerçekleştiği için sadece birkaç saat içinde tamamlanabilir.

PCR tamamlandıktan sonra, üretilen DNA fragmanlarının miktar ve boyutlarını kontrol etmek için elektroforez denilen yöntem kullanılabilir.

The post PCR (Polimeraz Zincir Tepkimesi) Nedir? appeared first on TechWorm.